本发明涉及一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法,包括以下步骤:(1)取抗凝血,将其与细胞裂解液混合形成混合液,向混合液中加入蛋白酶K(2)在55-65°C的温度下,水浴消化3-5小时;(3)加预冷的乙醇,充分混匀;(4)加双蒸水ddH
1.一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)取抗凝血,将其与细胞裂解液混合形成混合液,向混合液中加入蛋白酶K;(2)在55-65°C的温度下,水浴消化3-5小时;(3)加预冷的乙醇,充分混匀,乙醇使溶液中的DNA和部分蛋白一起沉淀;10000rpm离心5min,弃上清液;(4)加双蒸水ddH₂O溶解沉淀;10000rpm离心5min,吸上清液到干净的离心管中;(5)加入4mol/L的NaAc和预冷的乙醇,充分混匀;10000rpm离心5min,弃上清液,加75%的预冷乙醇,出现白色絮状沉淀,即基因组DNA;所述的细胞裂解液的组成是:0.5Mxa0EDTA35-45ml,1Mxa0Tris·HCl6-12ml,5Mxa0NaCl2-6ml,10%SDS8-12ml。
2.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法,其特征在于:步骤(1)中抗凝血与细胞裂解液的体积比为1:50。
3.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法,其特征在于:步骤(1)中蛋白酶K的加入量与抗凝血与细胞裂解液所形成混合液的比值为1:125。
4.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法,其特征在于:步骤(3)中乙醇的加入量占总体积的70%-90%。
5.根据权利要求1所述的快速提取禽类血液基因组DNA的方法,其特征在于:步骤(5)中使NaAc的含量为0.1-0.2mol/L,预冷的乙醇的浓度达到70%以上。技术领域
本发明涉及一种动物基因组DNA的提取方法,尤其涉及一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法。
背景技术
基因组DNA提取是分子生物学研究最基本的技术,DNA可以从各种样品材料中获得,包括抗凝血,凝固血,裂解血,软层细胞,毛囊等。目前常用的提取方法是酚-氯仿抽提法,该方法利用SDS破解细胞膜,释放细胞所含的蛋白质;再利用蛋白酶K分解释放的蛋白质,多余的没有被蛋白酶K分解的蛋白质被酚-氯仿抽提除去;剩余的基因组DNA用乙醇沉淀。该方法可以得到高纯度的基因组DNA,但需要的化学试剂也多,尤其用到了对皮肤有腐蚀作用的化学试剂——酚,对试验操作人员存在相当大的危险;此外,用到的酚、氯仿、异戊醇等试剂容易挥发,对实验室及其周边环境也会造成一定污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全的快速提取禽类血液基因组DNA的方法。为了实现上述目的,本发明的技术方案采用了一种快速提取禽类血液基因组DNA的方法,包括以下步骤:(1)取抗凝血,将其与细胞裂解液按1∶50混合(体积比),向混合液中加入蛋白酶K;(2)在55-65°C的温度下,水浴消化3-5小时;(3)加预冷的乙醇,充分混匀,乙醇使溶液中的DNA和部分蛋白一起沉淀;10000rpm离心5min,弃上清液;(4)加双蒸水ddH₂O溶解沉淀,乙醇使蛋白发生不可逆变性,沉淀中的蛋白不能溶解,而DNA可以再次溶解;10000rpm离心5min,吸上清液到干净的离心管中;(5)加入4mol/L的NaAc和预冷的乙醇,充分混匀;10000rpm离心5min,弃上清液,加75%的预冷乙醇,出现白色絮状沉淀,即基因组DNA。所述的细胞裂解液的组成是:0.5Mxa0EDTAxa035-45ml,1Mxa0Tris·HClxa06-12ml,5Mxa0NaClxa02-6ml,10%SDSxa08-12ml。所述的抗凝血与细胞裂解液的体积比为1∶50,蛋白酶K的加入量与混合液的比为1∶125。步骤(3)中乙醇的加入量占总体积的70%以上。步骤(5)中使NaAc的含量为0.1-0.2mol/L,预冷的乙醇的浓度达到70%-90%。本发明的方法针对酚-氯仿抽提法提取基因组DNA的缺点,结合禽血红细胞中含有细胞核,基因组DNA含量丰富的特点,提出了用乙醇进行两次沉淀,代替酚-氯仿抽提进行禽血基因组DNA提取的方法。本方法仅需10ul抗凝血,加入细胞裂解液裂解细胞后,用蛋白酶K消化溶液里的蛋白质,然后用乙醇沉淀基因组DNA和剩余的未被消化的蛋白质,弃上清液,将沉淀用ddH₂O溶解,由于乙醇使蛋白发生不可逆变性,所以沉淀中的蛋白不能溶解,而DNA可以再次溶解;转移上清液(含有基因组DNA)到新的1.5ml离心管中,第二次向溶液中加入高浓度乙醇,基因组DNA就可以再次沉淀,从而得到高纯度的基因组DNA。本方法快速、高效、无毒、经济,所得到的基因组DNA可以进行下一步的PCR、酶切等分子生物学分析。本发明的方法具有操作安全,没有环境污染;本方法进行禽血基因组DNA提取主要试剂是乙醇,没有用到酚、氯仿、异戊醇等有毒有害试剂,对操作者和环境都没有污染。另外,提取方法简单,结果可靠,基因组DNA提取过程中没有用到氯仿等溶剂,不出现液面分层和移上清液等难度较大的操作,因此,也不存在有机溶剂残留在提取的基因组DNA里,影响下面的操作(如PCR扩增、酶切)等问题。采用本发明的方法的提取过程所需要时间在1h以内。
附图说明
图1为本发明的方法提取的鹌鹑基因组DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测图。电泳条件:取4ul基因组DNA加1ulxa06×Loadingxa0buffer点样,8v/cm电泳30min后拍照。图2为用本方法提取的北京鸭基因组DNA用多对引物进行PCR扩增,扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测的照片。电泳条件:取4ulxa0PCR产物加1ulxa06×Loadingxa0buffer点样,8v/cm电泳30min后拍照。
具体实施方式
具体实施的方法如下:所用到的缓冲液和试剂如下:细胞裂解液:分别取0.5Mxa0EDTAxa040ml,1Mxa0Tris·HClxa010ml,5Mxa0NaClxa04ml,10%SDSxa010ml,定容至100ml。实际浓度为200mMxa0EDTA,pH值8.0;100mMxa0Tris·HCl,pH值8.0;200mMxa0NaCl,2%SDS。蛋白酶K:取100mg蛋自酶K溶于5ml灭菌ddH₂O,-20°C保存4mol/L的NaAc:称量54.4gxa0NaAc·3H₂O置于100ml烧杯中,加入40ml的ddH₂O搅拌溶解,加入冰醋酸调节pH值至5.2,定容至100ml,高压灭菌。TE缓冲液:取1Mxa0Tris-HCl(PH=8.0)5ml、0.5Mxa0EDTA(PH=8.0)1ml,定容到500ml,高压灭菌。75%乙醇:75ml乙醇(分析纯)加入25ml的ddH₂O,混匀。100%乙醇:分析纯具体步骤如下:(1)取10ul抗凝的鹌鹑血,加500ul细胞裂解液,再加4ul蛋白酶K,充分混匀;(2)在60°C的温度下,水浴消化3-4h;(3)加1000ul预冷的乙醇(分析纯),充分混匀,溶液中出现沉淀;(4)10000rpm离心5min,弃上清液;(5)加300ulxa0ddH₂O,上下剧烈颠倒,溶解沉淀,沉淀不会完全溶解,因为沉淀中的蛋白质已经发生不可逆变性,不能再次溶解;而沉淀中的基因组DNA可以再次溶解;(6)10000rpm离心5min,吸上清液(约300ul)到干净的离心管中;加50ulxa04mol/L的NaAc,900ul预冷的乙醇(分析纯),上下缓慢颠倒,充分混匀,出现白色絮状沉淀(基因组DNA);(7)10000rpm离心5min,弃上清液,加75%的预冷的乙醇700ul,上下缓慢颠倒混匀;(8)10000rpm离心5min,弃上清液,用200ul移液器吸干离心管底部的液体,室温干燥5~10min;(9)加50~200ulxa0TE溶解,用移液器反复吹打数次,室温放置10min,以溶解基因组DNA。